图1 串联基因片段GV序列 Figure 1 Sequence of the tandem gene fragment of ‘GV’

1.2入门载体构建及鉴定
将连接后得到的片段“GV”进行TOPO Cloning之后，用菌液进行PCR扩增的结果(图2)：当以GV-F和GV-R为引物进行PCR扩增后，其阳性克隆的扩增产物电泳可见约825 bp的条带，与预期片段大小相符合；而在以M13-F和GV-R作引物进行PCR扩增后，电泳后出现的片段明显比插入片段要大，结果表明GV片段连接进入到载体pENTR/SD/D-TOPO中，即通过该步骤成功构建了入门克隆载体。进一步的核苷酸测序结果表明，“pEN-GV”上的连接片段与前期获得的“GV”片段相似度为100%，证实了该干扰片段以正确的方向插入到入门载体中。

图2 TOPO Cloning阳性克隆的PCR鉴定 注: M: DL2000 marker; 1: 阳性克隆以M13-F&GV-R作引物PCR扩增; 2: 阳性克隆以GV-F&GV-R作引物PCR扩增 Figure 2 PCR identification of positive clones of TOPO cloning products Note: M: DL2000 marker; 1: Amplification of PCR products with a positive clone using primers of M13-F&GV-R; 2: Amplification of PCR products with a positive clone using primers of GV-F&GV-R.

1.3 RNAi载体构建及鉴定
本研究对PCR检测为阳性(电泳出现约825 bp条带)的阳性质粒进行酶切鉴定的结果(图3)：重组质粒在经XhoⅠ和XbaⅠ单酶切后，切下的片段大小约为900 bp，与未经LR反应的空载Phellsgate12酶切片段的大小明显不同，而空载经XhoⅠ酶切片段大小为1 429 bp、经XbaⅠ酶切片段大小为1 419 bp，各酶切片段的大小符合预期结果。这表明，本试验所构建的RNAi载体中，干扰片段“GV”形成了正确的Hairpin结构。
 

图3 目标载体Ph12-GV的酶切鉴定 注: 3-A: XholⅠ酶切鉴定; 3-B: XbaⅠ酶切鉴定; M: DL2000 marker; 1: Ph12-GV阳性克隆酶切; 2: Phellsgate12空载酶切 Figure 3 Restriction enzyme identification of the target vector Ph12-GV Note: 3-A: Restriction enzyme identification of XholⅠ; 3-B: Restriction enzyme identification of XbaⅠ; M: DL2000 marker; 1: Enzyme digestion of the positive clones from Ph12-GV; 2: Enzyme digestion of the empty vector Phellsgate12

1.4 RNAi载体转入农杆菌及鉴定

用“Ph12-GV”质粒转化Agrobacterium菌株EHA105以后，用不同引物进行PCR鉴定的结果(图4)，用GV-F&GV-R作引物时，阳性克隆PCR扩增产物电泳出现了与干扰片段大小一致的片段(图4A)；用NPTⅡ-F & NPTⅡ-R作引物时，PCR扩增产物电泳出现了714 bp大小的条带(图4B)，片段大小均符合预期结果，由此说明“Ph12-GV”已转入根癌农杆菌中。

图4 Ph12-GV转化农杆菌菌株EHA105阳性克隆的PCR鉴定 注: A: GV-F&GV-R作引物PCR; B: NPTⅡ-F& NPTⅡ-R作引物PCR; M: DL2000 marker; 1: EHA105空载PCR; 2-3: EH-GV阳性克隆PCR Figure 4 PCR identification of Ph12-GV positive clones transformed into Agrobacterium strain EHA105 Note: A: PCR products using primers of GV-F&GV-R; B: PCR products using primers of NPTⅡ-F& NPTⅡ-R; M: DL2000 marker; 1: PCR products of EHA105 empty vector；2-3: PCR products of EH-GV positive clones.

1.5根癌农杆菌介导法转化葡萄体细胞胚及转基因植株的RT-PCR检测

农杆菌介导法转化合子胚起源的葡萄体细胞胚的过程(图5)，转化后的体胚进一步培养在添加50 mg/L卡那霉素的筛选培养基上(图5E)，多数转化后的体细胞胚在继代培养过程中生长缓慢或变褐死亡，少数萌发后形成了抗性芽(图5F)，部分抗性芽在生根培养基上继续培养后生长停滞或死亡，仅有少数生长正常的抗性芽在离体条件下生根(图5G)，并形成完整植株(图5H)。提取再生植株幼嫩叶片中的总RNA，RT-PCR结果(图6)显示，当用内参基因的引物(Actin-F&Actin-R)进行扩增后，对照植株和转基因植株都能扩增出216 bp大小的预期条带，而以GV-F&GV-R作引物时，对照植株的cDNA扩增后电泳未见条带，转基因植株明显可见扩增片段(条带大小约为825 bp)，显示前期构建的RNAi载体所携带的外源基因片段已转入到受体材料葡萄体细胞胚中，并在转基因植株的RNA水平上获得表达。

图5 根癌农杆菌介导法转化“红宝石无核”葡萄体细胞胚 注: A~D: “红宝石无核”葡萄合子胚的获得及体细胞胚的诱导发生; E~H: 体细胞胚遗传转化及再生植株的获得 Figure 5 Somatic embryo tranformation of Ruby Seedless grape by Agrobaterium mediated method Note: A~D: Somatic embryos induced from zygotic embryos rescued from ‘Ruby Seedless’ grape; E~F: Transformation of somatic embryos by Agrobaterium and plant regeneration

图6 转基因植株的RT-PCR检测 注: M: DL2000 marker; 1: 未转化植株以GV-F&GV-R作引物RT-PCR; 2: 未转化植株以GV-F&GV-R作引物RT-PCR; 3, 5, 7, 9: 转基因植株以Actin-F&Actin-R作引物的RT-PCR; 4, 6, 8, 10: 转基因植株以GV-F&GV-R作引物的RT-PCR Figure 6 RT-PCR detection of the transformed plants Note: M, DL2000 marker; 1: RT-PCR of untransformed plants using Actin-F&Actin-R as primers; 2, RT-PCR of untransformed plants using GV-F&GV-R as primers; 3, 5, 7, 9: RT-PCR of transformed plants using Actin-F&Actin-R as primers; 4, 6, 8, 10: RT-PCR of a transformed plants using GV-F&GV-R as primers

2讨论
通过本研究，我们成功构建了含4种病毒CP基因片段RNAi载体，并转化葡萄体细胞胚获得了RT-PCR检测为阳性的转基因植株，有助于果树抗病基因工程研究。

在病毒的进化过程中，外壳蛋白基因序列具有高度的保守性，这种序列的保守性有助于维持其侵染寄主的稳定性。因此，利用植物病毒来源的基因构建载体进行遗传转化一直是植物获得抗病性的主要方法，也是葡萄抗病毒基因工程的主要策略。目前已成功转入葡萄的基因多为病毒的外壳蛋白基因，如GCMV、GFLV、GLRaV-2、GLRaV-3、GVA和GVB等的CP基因(Le Gall et al., 1994; Krastanova et al., 1995; Valat et al., 2006)，其中研究最多的是GFLV的CP基因(任芳等, 2013)，转入的基因多为单一病毒完整的CP基因。

近年来，利用RNAi这一技术策略进行葡萄抗病毒基因工程的研究始有报道(田莉莉等, 2012; 2014) 。前人的研究表明，转化不同病毒外壳蛋白基因的全部或部分片段，均能获得抗病的转基因植株(朱常香等, 2008)。而选取病毒基因组中相对保守的序列作为RNAi的靶片段，既可以获得抗多个病毒株系的转基因植株，又可以减少因病毒变异造成的转基因植株抗病性的丧失(Xu et al., 2009)，而且转入较小的片段更利于载体构建和遗传转化。考虑到我国葡萄生产中同一植株受到多种病毒复合侵染的情况十分常见(刘晓等, 2006)，我们分别从4种存在广泛的葡萄病毒外壳蛋白基因(GFLV, GLRaV, GVA和GVB)之中，克隆了其保守区段，经顺序串联形成干扰片段，并用Gateway方法构建了RNAi载体，转入农杆菌中获得了可用于植物遗传转化的工程菌，最终目的是通过转基因途径获得能同时抵抗这几种病毒病害的转基因植物新材料。

自上世纪九十年代以来，葡萄转基因技术的研究一直受到国内外研究者的关注。但与其它植物相比，进展相对缓慢。究其原因，再生效率低是限制葡萄遗传转化发展的瓶颈。一般认为，葡萄的再生体系主要有器官发生和胚状体发生两种途径，由于后者具有单细胞起源、不易产生嵌合体等优点，在遗传转化中具有更大的利用价值。根据已有的文献，迄今获得的转基因葡萄大多是通过胚状体发生途径获得的(Dhekney et al., 2008; Fan et al., 2008; Gambino et al., 2010; Krastanova et al., 1995; Mauro et al., 1995)。前人的研究表明，葡萄的许多部位如子房(Pradoa et al., 2010)、花药(Pradoa et al., 2010; Dhekney et al., 2012)等都能诱导发生体细胞胚，并以花药诱导产生的胚状体用于遗传转化的研究最为常见。同时，也有研究者指出，合子胚与体细胞胚具有相似的系统发育进程，是用于胚体发生和遗传转化的理想的原初外植体(Li et al., 2008)。本研究以“红宝石无核”葡萄通过合子胚诱导发生的体细胞胚作为受体材料，成功进行了葡萄的遗传转化，进一步丰富了葡萄转基因的受体材料来源。

在植物遗传转化过程中，筛选培养基中卡那霉素(Kan)的浓度是决定转基因成败的关键。Dhekney (2008)在对圆叶葡萄的体细胞胚进行遗传转化研究时指出，Kan在100 mg/L能较好地抑制非转化子的生长。我们的研究中分别在体胚萌发培养基和生根培养基中添加了50 mg/L和25 mg/L的Kan作为选择压，这是因为，我们在前期的试验中发现，“红宝石无核”的体细胞胚对Kan比较敏感，当培养基中加入的Kan浓度偏高时，绝大多数体细胞胚不能萌发，或萌发后的抗性芽发育畸形不能成苗，这可能是由于葡萄种间差异或体胚来源上的差异造成的。RT-PCR检测结果显示转基因植株为阳性，表明目的基因片段已成功转入受体细胞中并在RNA水平上得到表达，说明该技术路线是可行的。

3材料与方法
3.1材料
提取总RNA所用的葡萄品种为“藤稔”，6年生树，叶片采自郑州果树研究所，转基因所用受体材料为“红宝石无核”葡萄诱导发生体细胞胚。

3.2干扰片段的获得
依据NCBI数据库发布的基因序列信息(GFLV CP基因, 登录号为AY780901.1; GLRaV-3 CP基因, 登录号为HQ401017.1; GVA CP基因, 登录号为AB039841.1; GVB CP基因, 登录号为AB039842.1)，参照文献(田莉莉等, 2012; 2013; 2014)在各自的保守区域设计引物(序列信息见表1)。从田间采集幼嫩的葡萄叶片，用Trizol抽提植物总RNA，取1ug RNA，参照M-MLV反转录酶(Takara产品)说明书，反转录合成cDNA第一链，并用该cDNA为模板进行PCR扩增和电泳分析(Agarose浓度为1.0%)，具体步骤参照文献(田莉莉等, 2013)进行。在紫外灯下切下目标条带，用DNA回收纯化试剂盒(Takara产品)回收后连接到PMD19-T Vector (Takara产品)、测序，获得的重组质粒分别命名为P19T-GFLV, P19T-GLRAV-3, P19T-GVA和P19T-GVB。利用重叠延伸PCR方法将上述4个基因的保守区段顺序串联(技术路线见图7)，获得的大片段(命名为“GV”)转入PMD19-T载体后，采用位于序列两端的引物(P1和P8)进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，将阳性克隆(出现825 bp条带)委托上海生物工程技术服务公司测序，序列完全正确的克隆命名为“P19T-GV”。

表1 PCR扩增所用引物 Table1 Primers used for PCR amplification

图7 利用重叠延伸PCR获得目的基因干扰片段的技术路线 Figure 7 The technology sketch of obtaining the interference fragment of target gene using via overlapping PCR

3.3入门克隆载体构建及鉴定
以GV-F(5'端加上序列接‘CACC’)和GV-R为上、下游引物，对3.2所得“P19T-GV”质粒进行PCR扩增(所用聚合酶为pfu酶, Fermentas产品)，进行PCR扩增，退火温度56℃，PCR产物经1.0%的Agarose凝胶电泳后将目标条带切胶回收后进行TOPO cloning，本试验采用6 μL反应体系，各组分用量按照pENTR™/SD/D-TOPO® TOPO Cloning Kit (美国Invitrogen公司))说明书并参照文献(田莉莉等, 2012; 2013; 2014)进行，加样混匀后置于温箱内25℃反应25 min后，用热激法对E. coli Top10感受态细胞(本实验室制备)进行转化。无菌条件下将转化后的细胞均匀涂布在含75 mg/L卡那霉素(Kanamycin, Kan)的固体LB培养基上，将涂有菌液的培养皿倒置，37℃过夜培养，将单克隆挑至Kan浓度相同的LB液体培养基内，震荡培养14 h (培养条件为37℃, 150 r/min),以菌液为模板用2对引物(GV-F&GV-R和M13-F&GV-R)进行PCR扩增，将扩增产物条带正确的克隆委托上海生物工程技术服务公司测序，序列正确的阳性克隆命名为入门克隆载体“pEN-GV”。

3.4 RNA干扰载体的构建及鉴定
将目标载体Phellsgate12(澳大利亚CSIRO公司产品)和步骤3.3获得的入门克隆载体“pEN-GV”进行LR反应，具体参照Gateway® LR Clonase® II Enzyme Mix Kit (美国Invitrogen公司)说明书及文献(田莉莉等, 2013; 2014)进行，采用10 μL的反应体系，加样混匀后置于25℃温箱内12 h后终止反应(加入蛋白酶K)。热激法转化E. coli Top10感受态细胞(由本实验室制备)后，在含100 mg/L壮观霉素(Spectinomycin, Spec)的LB固体培养基上涂布均匀，将涂有菌液的培养皿倒置，37℃培养16 h后，将获得的单克隆接种在含Spec浓度相同的LB液体培养基，震荡培养14 h (37℃, 150 r/min)。以菌液为模板进行PCR初检，试验所用特异引物为GV-F& GV-R，1.0% Agarose凝胶电泳后，对扩增出预期片段(GV)大小的菌液和Phellsgate12菌液抽提质粒，进行进一步的单酶切鉴定，试验所用内切酶为XhoⅠ和XbaⅠ(均为Takara产品)，切出预期条带的阳性质粒命名为“Ph12-GV”(RNA干扰载体)(结构见图8)。

图8 RNAi表达载体Ph12-GV的结构 Figure 8 Construction of the RNAi vector Ph12-GV

3.5 RNA干扰载体对农杆菌的转化及鉴定
将步骤3.4获得的“Ph12-GV”载体质粒，采用冻融交替方法对农杆菌菌株EHA105感受态细胞(由本实验室制备)进行转化，在添加50 mg/L利福平(Rifampicin, Rif)和100 mg/L Spec的YEB固体培养基上涂布均匀，将涂有菌液的培养皿倒置，置于28℃温箱内培养46 h，将获得的单克隆接种在至含有相同浓度的Rif和Spec的YEB液体培养基，进行震荡培养36 h (28℃, 180 r/min)。以菌液为模板用2对引物(GV-F&GV-R和NPTⅡ-F& NPTⅡ-R)分别进行PCR扩增和1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定为阳性的克隆命名为“EH-GV”，可用于农杆菌介导的植物遗传转化。

3.6葡萄体细胞胚的诱导
花后40 d采集“红宝石无核”幼果，先用流水冲洗果粒5~10 min，置于超净工作台上，用75%的酒精浸泡1 min后无菌水冲洗1次，再用0.1%的HgCl2浸泡5~8 min，无菌水漂洗3次，消毒后的果粒置于灭菌培养皿中，无菌条件下纵剖果实，取出胚珠，接种在“固-液双相”的NN培养基上(图5A)，培养6周后无菌条件下纵剖胚珠，取出发育的合子胚(图5B)，选择1 mm大小的幼胚接种在固体的NN+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D培养基上诱导胚性愈伤组织，4周后将获得的胚性愈伤组织(图5C)接种在固体的NN+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA培养基上诱导发生体细胞胚，在胚性愈伤组织表面选择发育阶段在子叶型期的体细胞胚(图5D)用于遗传转化。

3.7农杆菌介导法转化葡萄体细胞胚及转基因植株检测
将EH-GV菌液28℃震荡培养至OD≈0.5，6 000 r/min离心10 min后收集菌体，用等体积的WPM培养基重悬，将体细胞胚用农杆菌菌液浸泡侵染8~10 min后，接种在WPM培养基上暗培养3 d，接种在WPM+0.2 mg/L 6-BA+50 mg/L Kan+ 200 mg/L Cef (Cefotaxime, 头孢霉素)+200 mg/L Carb (Carbenicillin, 羧苄青霉素)培养基上，每2周继代一次，光周期为16 h/8 h，将抗性芽转至1/2 MS+0.2 mg/L IBA+200 mg/L Cef+200 mg/L Carb的固体培养基培养4~6周，培养条件同上。选择生根情况良好的幼苗，按照步骤3.2所述的方法抽提植物的总RNA并合成第一链cDNA，再用该cDNA为模板进行RT-PCR扩增，引物分别为用于扩增葡萄内参基因Actin (AF369524.1)的引物Actin-F&Actin-R(目标片段216 bp)，用于扩增干扰片段的引物GV-F&GV-R，产物用1.0% Agarose进行凝胶电泳分析。
 

作者贡献

田莉莉是本研究的实验设计和实验研究的主要执行人，也是项目的构思者及负责人；牛良协助完成了论文的写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31071768)资助。

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